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Structural basis for molecular recognition and function of proteins in alternative mRNA splicing and host-parasite immunobiology.

Strukturelle Grundlage für die molekulare Erkennung und Funktion von Proteinen des alternativen mRNA-Spleißen und in der Wirt-Parasit-Immunbiologie.

München, Technische Universität, Fakultät für Chemie, Diss., 2011, 91 S.
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Proteins play a fundamental role in nearly all biological processes by interacting with other proteins, nucleic acids or small molecules. The interplay of proteins and macromolecules can lead to the assembly of structurally complex and highly dynamic molecular machines, with diverse functions in gene expression, cell growth, cell cycle, metabolic pathways, signal transduction, protein folding and transport. The nature of these interactions is governed by the three-dimensional structures of the proteins involved. Therefore, research into the structure and function of proteins (structural biology) has become indispensable in life sciences. Besides X-ray crystallography, Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy is applied to determine the structure of biological macromolecules. Moreover NMR is essentially the only method to detect dynamics on a wide range of timescales, ranging from ns to days, on sub-molecular level in solution. The present thesis delivers two conclusive examples, where knowledge of the protein structure has provided critical insight into the function, and accordingly, the rationale behind cell biology assays to validate the structural findings. The first study reveals novel structural aspects in the regulation of alternative mRNA splicing regulation by the protein Sam68. The second study addresses the question of how Schistosoma mansoni (S. mansoni), a parasitic worm, can manipulate and exploit the host immune system by only a single glycoprotein named interleukin-4-inducing principle of S. mansoni eggs (IPSE/alpha-1). Chapter 1 introduces NMR as an important tool in structural biology. Additionally, certain aspects of gene regulation and immunobiology, which are related to the structural projects of the thesis, are reviewed. Chapter 2 provides a structural and functional characterization of the Src associated during mitosis, 68 kDa protein (Sam68). Sam68 is a member of the signal transducer and acativator of RNA (STAR) domain family, which regulate certain aspects of RNA metabolism, e.g. alternative mRNA splicing. Typically, the STAR domain has a Qua1-KH-Qua2 domain organisation. The solution structure of its Qua1 homodimerization domain was determined by NMR spectroscopy. The two monomers assemble perpendicular with respect to each other in an unusual arrangement of four helices. This interaction is critical for the function of Sam68 in alternative RNA splicing, as revealed by a cell-based mutational assay. Similar to its sequence homolog human splicing factor 1 (SF1), the RNA-binding K homology (KH) domain is extended by the Qua2 domain, which contacts the target RNA. Unlike SF1, a novel N-terminal extension of the KH-fold, may contribute to the RNA binding of Sam68. These findings could explain the differential RNA binding specificities of the two proteins. Binding of Sam68 to its target RNA guides the constitutive splicing factor U2 auxiliary factor, 65 kDa (U2AF65) to alternative splice sites. NMR titration experiments show, that U2AF65 can bind to the C-terminus of Sam68. This interaction most likely stabilizes the binding of U2AF65 to pre-mRNA regulatory sequences and initiates the formation of the spliceosome at weak splice sites. These data conclusively correlate the structure of Sam68 to its cellular function and reveal how Sam68 regulates the targeting of the spliceosome to alternative splice sites. Chapter 3 describes the structural analysis of the interleukin-4-inducing principle of S. mansoni eggs (IPSE/alpha-1), a major immunogenic component of S. mansoni. The stimulation of a T-helper 2 cell (TH2) response of the host's immune system upon infection with S. mansoni involves the specific binding of IPSE/alpha-1 to IgE antibodies on the surface of basophilic granulocytes, which is not mediated by the canonical antigen-antibody interaction. I was able to solve the solution structure of the IPSE/alpha-1 and show that it is a protein of the β/γ-crystallin family. It bears unique structural features which enable the protein to specifically bind to Immunoglobulin (Ig) E. I identified a large positively charged interaction interface on IPSE/alpha-1, presumably binding to a negatively charged patch, provided by the asymmetrically bent IgE molecule. This binding supports a model of basophile activation, which is triggered by the binding of IPSE/alpha-1 to receptor-bound IgE. Presumably, a conformational changes of the IgE molecule leads to subsequent IgE-receptor activation. The implications from this specific protein-protein interaction enhance our understanding on the mechanisms involved in the manipulation of the host's immune system by S. mansoni.
Die Interaktion von Proteinen mit anderen Proteinen, Nukleinsäuren und kleinen Molekülen ist die Grundlage nahezu jedes biologischen Prozesses. Das Zusammenspiel von Proteinen und Makromolekülen erlaubt die Bildung komplexer Strukturen bis hin zu dynamischen molekularen Maschinen. Diese üben unterschiedlichste Funktionen in der Genexpression, im Zellzyklus und -wachstum, im Stoffwechsel, in der Signalweiterleitung sowie in der Proteinfaltung und im Proteintransport aus. Die Art der Wechselwirkungen wird maßgeblich von der räumlichen Struktur der beteiligten Proteine bestimmt. Die Aufklärung der Raumstruktur von Proteinen und deren Funktion (Strukturbiologie) ist daher ein unverzichtbarer Bestandteil der Lebenswissenschaften. Neben der Röntgenstrukturanalyse wird die Kernspinresonanz- (engl. Nuclear Magnetic Resonance, NMR) Spektroskopie zur Strukturbestimmung von biologischen Makromolekülen verwendet. NMR ist dabei die einzige Methode zur Untersuchung submolekularer, dynamischer Vorgänge auf einer Zeitskala von Nanosekunden bis Tagen in Lösung. Die vorliegende Doktorarbeit beschreibt anhand zweier Beispiele, dass die Kenntnis der Raumstruktur eines Proteins kritische Einblicke in dessen Funktion geben kann. Auf dieser Grundlage können zellbiologische Experimente entworfen werden, um die gewonnen Erkenntnisse über den Zusammenhang von Struktur und biologischer Funktion zu überprüfen. Die erste Studie zeigt neue, strukturelle Aspekte in der Regulation des alternativen Spleißens von Boten-RNA (mRNA) durch das Protein Sam68 auf. Die zweite Studie befasst sich mit der Frage, wie der parasitäre Wurm Schistosoma mansoni das Immunsystem seines Wirtes mittels eines einzigen Proteins, IPSE/alpha-1, manipulieren und zu seinen Zwecken ausnutzen kann. Kapitel 1 beschreibt die NMR als wichtiges Werkzeug der Strukturbiologie. Darüber hinaus werden verschiedene, für die Projekte dieser Doktorarbeit relevante Aspekte der Genregulation und Immunbiologie erörtert. Kapitel 2 liefert die strukturelle und funktionale Charakterisierung des Proteins Sam68 (Src associated during mitosis, 68 kDa protein). Sam68 ist ein Mitglied der STAR (Signal transducer and activator of RNA)-Domänenfamilie, die mit der Regulierung verschiedene Aspekte des RNA Metabolismus, wie zum Beispiel dem alternative Spleißen von mRNA, assoziiert ist. Typischerweise weist die STAR Domäne eine Qua1-KH-Qua2 Domänen¬organisation auf. Die Raumstruktur der Qua1 Homodimerisierungsdomäne von Sam68 in Lösung wurde mittels NMR Spektroskopie bestimmt. Die beiden Monomere lagern sich rechtwinklig zueinander an und bilden so eine ungewöhnliche Anordnung von vier Helices. Durch Mutationsanalyse in einem zellbasierten Assay konnte gezeigt werden, dass diese Interaktion entscheidend für die Aktivität von Sam68 im alternativen mRNA-Spleißen ist. Die RNA-bindende KH (K homology) Domäne ist analog zum homologen Protein SF1 (splicing factor 1) durch die Qua2-Domäne erweitert. Im Gegensatz zu SF1 ist die KH-Faltung in Sam68 auch N-terminal erweitert. Die Bindung von Sam68 an die Ziel-RNA rekrutiert den konstitutiven Spleißfaktor U2AF65 (U2 auxiliary factor, 65 kDa) zur Spleißstelle. NMR Titrationsexperimente zeigen, dass U2AF65 an den C-Terminus von Sam68 binden kann. Diese Interaktion stabilisiert sehr wahrscheinlich die Bindung von U2AF65 an Regulationssequenzen auf der prä-mRNA und trägt dadurch zur Assemblierung des Spleißosoms an schwachen Speißstellen bei. Die Ergebnisse liefern eine Korrelation der Struktur von Sam68 mit seiner zellulären Aktivität für die Erkennung alternativer Spleißstellen. Kapitel 3 beschreibt die Strukturanalyse des Proteins IPSE/alpha-1 (interleukin-4-inducing principle of S. mansoni eggs), welches ein Hauptimmunogen von S. mansoni ist. Die Stimulierung einer T-helfer-2-Zellen (TH2)-Antwort des Wirtimmunsystems in Folge der Infektion mit S .mansoni geht mit der spezifischen Bindung von IPSE/alpha-1 an Immunoglobulin (Ig) E Antikörper auf der Oberfläche basophiler Granuloyzten einher. Diese Bindung ist jedoch keine typische Antigen-Antikörper-Reaktion. In der vorliegenden Arbeit konnte ich die Struktur von IPSE/alpha-1 in Lösung aufklären. Meine Ergebnisse zeigen, dass IPSE/alpha-1 eine β/γ-Crystallin-Faltung einnimmt. Die strukturellen Merkmale des Proteins ermöglichen die spezifische Bindung an den IgE Antikörper. Die Kristallstruktur von IgE zeigt einen großflächigen negativ geladenen Bereich, der an eine positiv geladenen Interaktionsfläche auf IPSE/alpha-1 bindet. Dieser Bindungsmodus unterstützt das Modell einer Basophilenaktivierung, die durch eine Interaktion von IPSE/alpha-1 mit Rezeptor-gebundenem IgE ausgelöst wird. Möglicherweise aktiviert eine konformationelle Änderung des asymmetrischen IgE-Moleküls schließlich den IgE-Rezeptor. Die Schlussfolgerungen aus dieser spezifischen Protein-Protein-Wechselwirkung erweitern unser Verständnis über die Mechanismen, die zur Manipulation des Wirtsimmunsystems durch S. mansoni führen.
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Publikationstyp Sonstiges: Hochschulschrift
Typ der Hochschulschrift Dissertationsschrift
Quellenangaben Band: , Heft: , Seiten: 91 S. Artikelnummer: , Supplement: ,
Hochschule Technische Universität
Hochschulort München
Fakultät Fakultät für Chemie