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Identification of novel mouse Delta1 target genes: Combination of transcriptomics and proteomics.

Identifizierung neuer Zielgene des Delta1-Gens der Maus: Eine Kombination aus Transkriptom- und Proteomanalyse.

München, Technische Universität, Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan, Diss., 2005, 147 S.
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The Delta/Notch signal transduction pathway is an evolutionary conserved pathway involved in many diverse developmental processes. These include neurogenesis, somitogenesis, left-right development, pancreatic development and development of the sensory hair in the inner ear. Numerous genes have been identified in the last years that are part of the signal transduction pathway or can influence the pathway in a way. A model to explain the process of lateral inhibition, one of the main features of the pathway, has been established. However, it is not clear how the known genes involved in Delta/Notch signalling can account for such diverse processes. In order to get new insights into the regulation of Delta/Notch signalling and to identify targets of Dll1 the transcriptome and the proteome of E10.5 wildtype and Dll1-/- embryos was analysed using DNA-chip technology and 2D-gelelectrophoresis combined with mass spectrometry. In the transcriptome analysis 22 up- and 30 downregulated transcripts were identified. In the proteome analysis 13 proteins were up- and 37 proteins were downregulated at E10.5. Further methods to verify the data on transcriptomics side included whole mount in situ hybridisation and real-time PCR and semi-quantitative immunoblotting on the proteomics side. The most promising candidate out of this analyses is the gene Ifitm1 which shows expression in regions where Delta/Notch signalling is known to occur, namely the presomitic mesoderm and the latest formed somites. The expression was strongly reduced in Dll1, Dll3 and Jag1 mutants which indicates a direct connection between Dll1 or Delta/Notch signalling respectively, and Ifitm1. Furthermore Ifitm1 was only recently discovered as marker for primordial germ cells and has no assigned function so far. To assess the exact function of Ifitm1 in the mouse a classical knockout targeting construct has been designed and prepared. The knockout animals will provide insights into the relevance of Ifitm1 for somitogenesis and other developmental processes. Further genes have been identified which show expression patterns indicative of Delta/Notch signalling and which also were altered in Dll1 mutant mouse embryos, and some also in Dll3 and Jag1 embryos. These genes are Csk, Ddx6, Nes, Sema5b and Smarcc1. On the protein level a number of interesting proteins have been identified. These include six subunits of the 26S proteasome, four translation initiation or elongation factors, proteins involved in cell signalling such as two 14-3-3 proteins and proteins involved in intracellular transport. Taken the data from the transcriptome and proteome analyses together it seems to become clear that in the Dll1 mutant many cellular processes might be altered. Regulation on the genomic level seems to be disturbed at the process of chromatin remodelling, regulation on post-transcriptional levels seems to be disturbed at the process of translation initiation and elongation as well as at the process of protein degradation through the proteasome. Intracellular trafficking seems to be altered on the level of phosphorylation and dephosphorylation through protein phosphatase 2A (PP2A) and C-src tyrosine kinase (Csk), as well as through the 14-3-3 proteins. Further aspects of intracellular trafficking involve the cytoskeleton. Nestin and g-tubulin, two components of the cytoskeleton were deregulated in the Dll1 mutant. Furthermore intracellular membrane trafficking seems to be disrupted through the downregulation of the SNARE protein Nsf and its interaction partner Munc18-3. It also seemed to turn out that developmental processes are altered in the mutants. Four transcription factors have been identified which have not been brought into context with Delta/Notch signalling before. It is not clear yet if they might play roles on the side of the signalling (Delta expressing) or the receiving (Notch expressing) cell. Neural crest cell migration also seems to be altered since Sema5b a gene involved in axonal guidance was downregulated in the Dll1 mutant embryos. Using a combination of transcriptomics and the proteomics approaches it could be shown that RNA- and protein expression profiling are both versatile and powerful approaches which complement each other. Thus it was possible to gain new insights into regulatory processes which would not have been possible with one approach alone.
Der Delta/Notch Signaltransduktionsweg ist eine an vielfältigen Entwicklungsprozessen beteiligte, evolutionär konservierte Signalkaskade. Bisher wurde die Wirkungsweise während der Neurogenese, Somitogenese, links-rechts Achsenbildung, Pakreasentwicklung und der Entwicklung der sensorischen Härchen im Innenohr beobachtet. In den letzten Jahren wurde eine Anzahle von Genen identifiziert, die direkt an der Signaltransduktion beteiligt sind, oder die den Wechselweg auf verschiedene Weise beeinflussen. Für den wichtigen Entwicklungsprozess der lateralen Inhibition, der von Delta/Notch Signaltransduktion gesteuert wird, wurde ein Modell etabliert. Es bleibt jedoch unklar, wie die begrenzte Anzahl an bisher identifizierten Genen eine solche Vielfalt an Entwicklungsprozessen steuern kann. Um neue Einblicke in die Regulation der Delta/Notch Signaltransduktionskaskade zu gewinnen und um Zielgene von Dll1 zu identifizieren wurde das Transkriptom, sowie das Proteom von 10.5 dpc Wildtyp und Dll1 mutanten Mausembryonen untersucht. Dazu wurde die DNA-Chip Technologie und 2D-Gelelektrophorese kombiniert mit Massenspektrometrie durchgeführt. Durch die Transkriptomanalyse wurden in der Dll1 Mutante 22 hoch- und 30 herunter regulierte Gene identifiziert. Die Proteomanalyse lieferte 13 hoch- und 37 herunter regulierte Proteine am Tag 10.5 der Embryonalentwicklung. Zur Bestätigung und weiteren Analyse der identifizierten Kandidaten wurde Real-Time PCR und Ganzkörper in situ Hybridisierung auf Nukleinsäure-Ebene und semi-quantitatives Immunoblotting auf Protein-Ebene durchgeführt. Der aussichtsreichste Kandidat der Analysen ist das Gen Ifitm1. Es ist in Regionen des Embryos exprimiert von denen man weiß, dass dort Delta/Notch Signalübertragung stattfindet, wie beispielsweise im präsomitischen Mesoderm und den jüngsten Somiten. In Dll1, Dll3 und Jag1 mutanten Mausembryonen war die Expression in diesen Regionen deutlich reduziert, was auf eine direkte Verbindung zwischen Dll1, bzw. Delta/Notch Signaltransduktion und Ifitm1 hinweist. Ifitm1 wurde erst kürzlich als Markergen für primordiale Keimzellen identifiziert, eine genaue Funktion ist bisher nicht bekannt. Um die Funktion von Ifitm1 detailliert untersuchen zu können wurde ein klassisches Targeting Konstrukt entworfen und hergestellt. Mit Hilfe der Knock-out Tiere werden neue Einblicke in die Bedeutung von Ifitm1 für die Somitogenese und andere Entwicklungsprozesse gewonnen werden. Es wurden weitere Gene gefunden, die ein bezüglich Delta/Notch Signaltransduktion bemerkenswertes Expressionsmuster zeigen, und deren Expression in Dll1 Mutanten, sowie auch in Dll3 und Jag1 Mutanten verändert war. Diese Gene sind Csk, Ddx6, Nes, Sema5b and Smarcc1. Auch auf Protein-Ebene wurde eine Reihe interessanter Proteine identifiziert. Dazu gehören beispielsweise sechs Untereinheiten des 26S Proteasoms, vier „translation initiation“ bzw. „elongation“ Faktoren, Proteine der Signalisierungskaskade der Zellen, wie zwei 14-3-3 Proteine und Proteine, die in den intrazellulären Transport involviert sind. Betrachtet man die Daten der Transkriptom- und Proteomanalyse gemeinsam so scheint klar zu werden, dass in der Dll1 Mutante eine Anzahl an zellulären Prozessen beeinträchtigt sein könnte. Auf genomischer Ebene scheint die Regulation der Chromatin Modellierung verändert zu sein. Die post-transkriptionelle Regulation scheint auf der Ebene der Initiierung sowie der Elongation der Transkription ebenso gestört zu sein, wie auch bei dem Prozess der Protein Degradation am Proteasom. Intrazelluläre und regulatorische Transportmechanismen scheinen auf der Ebene der Phosphorylierung und Dephosphorylierung durch Protein Phosphatase 2A (PP2A) und C-src Tyrosin Kinase (Csk) und auch durch 14-3-3 Proteine verändert zu sein. Intrazellulärer Transport hängt weiterhin vom Cytoskelett ab. Zwei Komponenten des Cytoskeletts, Nestin und g-Tubulin, sind reguliert in der Dll1 Mutante. Durch verminderte Expression des SNARE Proteins Nsf, wie auch dessen Interaktionspartner Munc18-3, scheinen auch Transportmechanismen, die mit Hilfe der Zellmembran ablaufen, beeinträchtigt zu sein. Weiterhin scheinen auch Entwicklungsprozesse in der Mutante betroffen zu sein. Beispielsweise wurden vier Transkriptionsfaktoren identifiziert, die noch nie mit der Delta/Notch Signaltransduktion in Zusammenhang gebracht wurden. Im Moment bleibt offen, ob diese Transkriptionsfaktoren auf der Seite der Delta exprimierenden, signalgebenden Zelle, oder auf der Seite der Notch exprimierenden, signalempfangenden Zelle eine Rolle spielen. Eine mögliche Beeinträchtigung der Wanderung der Neuralleistenzellen könnte durch die verminderte Expression von Sema5b angezeigt werden. Sema5b ist in den Prozess der Wegleitung der Neuronen involviert. Mit Hilfe einer Kombination aus Analysen des Transkriptoms und des Proteoms konnte gezeigt werden, dass RNA- und Protein-Expression Profiling zwei vielseitige und leistungsstarke Ansätze sind, die einander komplementieren. Es war auf diese Weise möglich neue Einblicke in regulatorische Mechanismen zu erhalten, die man mit einer Methode allein nicht hätte bekommen können.
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Publikationstyp Sonstiges: Hochschulschrift
Typ der Hochschulschrift Dissertationsschrift
Schlagwörter Notch; Dll1; Delta-like 1; Delta1; Dll3; Jag1; Ifitm1; Mil-2; Smarcc1; Srg3; SWI/SNF; Nsf; 14-3-3; Csk; Somitogenesis; Microarray; Transcriptome; Proteome; Proteasome pathway; Intracellular trafficking; Notch; Dll1; Delta1; Delta-like 1; Dll3; Jag1; Ifitm1; Smarcc1; Srg3; SWI/SNF; Nsf; 14-3-3; Csk; Somitogenese; Microarray; Transkriptom; Proteom; Proteasome Pathway; Intrazellulärer Transport
Quellenangaben Band: , Heft: , Seiten: 147 S. Artikelnummer: , Supplement: ,
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Hochschulort München
Fakultät Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan