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Die Identifikation und Charakterisierung neuer Spemann/Mangold Organisatorgene.

The identification and characterisation of novel Spemann/Mangold organizer genes.

München, Technische Universität, Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan, Diss., 2009, 170 S.
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Die Organisatorregion des Embryos ist eine hoch spezialisierte und transiente Struktur, die in allen Vertebraten zu finden ist und den grundlegenden Körperbauplan des Embryos festlegt. Seit der Entdeckung im Jahre 1924 durch Hans Spemann und Hilde Mangold war es das Ziel vieler Studien, die molekulare Natur des Organisators zu beschreiben. Foxa2 ist ein wichtiges Organisatorgen. Um die Biologie und die Funktion des Organisators besser zu verstehen, war es das Ziel dieser Arbeit neue Foxa2 Zielgene und Organisatorgene zu identifizieren. Dazu wurde das Genexpressionsprofil von Wildtyp und Foxa2 -/- Embryonen miteinander verglichen und eine große Anzahl an signifikant herunterregulierten Genen identifiziert. Das Expressionsmuster von 314 unbekannten Genen wurde in einem in situ Hybridisierungsscreen analysiert. Davon zeigten 10 Gene (3,1%) ein Expressionsmuster in der Organisatorregion des Embryos. Bisher waren nur 49 Gene bekannt, die in dieser hoch spezialisierten Region exprimiert sind. Wir konnten diese Liste um 20% erweitern und spekulieren nun, wie diese Gene ein Foxa2-abhängiges molekulares Programm des Spemann/Mangold Organisators regulieren. Wir analysierten eines dieser unbekannten Gene 1700027A23rik (Pitchfork) molekular und funktionell. Pitchfork ist unter den Chordaten hoch konserviert und nur in Regionen exprimiert, die für die Musterbildung des Embryos wichtig sind, wie in den monoziliären Zellen des Primitivknotens, in der Bodenplatte des Neuralrohres und in der apikalen Ektodermalzone der sich formenden Extremitäten. Happloinsuffizienz von Pitchfork führt zu duplizierten und gespaltenen Zilien im Primitivknoten, zu Infertilität, postaxialer Polydaktylie und zu Defekten in der Links-Rechts-Asymmetrie, die einen embryonal letalen Herzdefekt verursachen. Pitchfork akkumuliert in Vesikeln, während des Auf- und Abbaus von Zilien und ist während der ersten Schritte der Ziliogenese mit Zentrosomen und Basalkörpern assoziiert. Primär ziliäre PitchforklacZ/+ Zellen können beim Wiedereintritt in den Zellzyklus das Zilium nicht abbauen, was zu einer Überreplikation von Zentriolen und zu multiziliären Zellen führt. Pitchfork interagiert physisch mit b-Tubulin, mikrotubulären Motorproteinen, zentrosomalen und Basalkörper-Proteinen, was eine Funktion im mikrotubuliabhängigen Transport impliziert. Durch die funktionelle und molekulare Analyse dieses neuen Gens konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass der mikrotubuliabhängige vesikuläre Transport für die Umwandlung der Basalköper zu Zentrosomen in primären Zellen eine Rolle spielt. Pitchfork interagiert ebenso mit Proteinen, die in menschliche Ciliopathien involviert sind, was eine Beteiligung an der Entstehung von Krankheiten impliziert. Durch die Analyse von Pitchfork ergibt sich nun die Möglichkeit, den Zusammenhang zwischen menschlichen Ciliopathien und den molekularen Ursachen besser verstehen zu können.
To identify genes specific to the Spemann/Mangold organizer, we performed a microarray-based screen that compared wild-type and Foxa2 mutant embryos at late gastrulation stage (E7.5). We could detect genes that were consistently down-regulated in replicate pools of mutant embryos versus wild-type, and these included a number of known node and DE markers. We selected 314 genes without previously published data at E7.5 and screened for expression by whole mount in situ hybridization. We identified 10 novel expression patterns in the node and 5 in the definitive endoderm. We identified a novel node gene (1700027A23rik), which we named Pitchfork, because suboptimal levels lead to cilia duplication and bifurcation, left-right asymmetry defects and heart failure. Pitchfork accumulates in vesicles during cilia assembly and disassembly, when basal bodies and centrosomes interconvert. The co-localization and physical interaction with microtubules, microtubule motor and centrosome/basal body proteins implicate a function in microtubule-dependent transport. Interestingly, reduced levels of Pitchfork lead to a failure of the basal body to disconnect from the cilia. This results in centriole over-replication in S phase leading to multi-ciliated cells after mitosis. In summary, our data demonstrates that microtubule-associated vesicular transport is essential for basal body-to-centrosome interconversion in primary ciliated cells.
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Publikationstyp Sonstiges: Hochschulschrift
Typ der Hochschulschrift Dissertationsschrift
Quellenangaben Band: , Heft: , Seiten: 170 S. Artikelnummer: , Supplement: ,
Hochschule Technische Universität
Hochschulort München
Fakultät Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan