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Effector pathway of the antiviral effect of interferons in Hepatitis B Virus infection.

Effektorweg der antiviralen Wirkung von Interferonen in der Hepatitis B Virus-Infektion.

München, Technische Universität, Fakultät für Medizin, Diss., 2013, 151 S.
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Having been used in hepatitis B therapy for more than 20 years, interferon-alpha (IFN-α) is still the only medication that may lead to virus clearance. Although the effect of IFN-α has been widely studied, its definite mode of action is still unclear. In the first part of the thesis, I investigated antiviral effect of murine IFN-α on HBV. mIFN-α restricts HBV replication at the level of HBV-RNA transcription and translation in vitro and in vivo. Different mIFN-α subtypes varied largely in their antiviral efficiency with mIFN-α 4 and 11 showing the strongest anti-HBV effect. Analysis of protein alignment revealed several potential important residues in IFN-α receptor binding region. The second part characterizes the IFN-α signaling pathway. Different HBV replicating hepatoma cell lines were used to examine anti-HBV activity of IFN-α and compared to PHH. IFN-α only elicited antiviral activity in HBV-infected HepaRG cells, but not in HBV-replicating Huh-7 or HepG2 cells. Detailed analysis of the IFN-α signaling pathway revealed that neither Huh-7 nor HepG2 cells responded properly to IFN-α, while HepaRG showed similar induction of IFN-stimulated genes as PHH did. Although the amount of IFN-α/β receptors and phosphorylated STAT (p-STAT) proteins were comparable in all cell lines tested, nuclear translocation of p-STATs was far more efficient in HepaRG cells. We therefore selected HepaRG cells as well as PHH to study IFN-α effects on HBV. The third part describes a novel antiviral mechanism of IFN-α, which affects HBV binding to its host cell. In differentiated HepaRG cells, the supernatant of IFN-α treated cells limited HBV infection. The IFN-α induced factor(s) bound to heparin columns indicating that they interact with heparan sulfate to compete with HBV. Mass spectrometry analysis suggested that complement factor H or fibronectin 1 may be the HBV binding inhibitor. The fourth part focused on the mechanism of noncytopathic viral clearance by IFN-α. In addition to its transcriptional and posttranscriptional effects, IFN-α significantly reduced HBV cccDNA, the template of HBV transcription, in HBV infected PHH and HepaRG cells. Specific 3D-PCR indicated HBV cccDNA sequence alterations. Sequence analysis showed C to U transition of the HBV cccDNA after IFN-α treatment. APOBEC3 family cytidine deaminases A3A and A3G were upregulated upon IFN-α treatment in a time and dose dependent manner. JAK-STAT signaling blockade or HIV-Vif expression proved that IFN-α induced cccDNA deamination by APOBEC3 leads to cccDNA degradation. Subcellular localization analysis and overexpression experiments demonstrated that A3A was the active effector. Treatment with a DNA repair enzyme cocktail corrected all mutations of cccDNA. AP endonuclease incubation reduced cccDNA showing that the base excision pathway was involved. Lacking host genomic DNA deamination upon IFN-α treatment shown suggested that A3A is directed specifically to viral DNA. Since A3A co-localized with HBV core protein in confocal microscopy and interaction was confirmed by co-immunoprecipitation, we propose that A3A utilizes HBc to get access to cccDNA. Taken together, this thesis leads to a better understanding of the antiviral function of IFN-α and opens new options for the development of novel and safe treatments to eradicate HBV and to cure chronic hepatitis B.
Interferon-alpha (IFN-α), das einzige Medikament, das zu einer vollständigen Eliminierung des Virus führen kann, wird seit mehr als 20 Jahren eingesetzt. Obwohl der Effekt von IFN-α weitgehend untersucht worden ist, ist sein genauer Wirkmechanismus noch ungeklärt. Der erste Teil der Arbeit untersucht die antivirale Wirkung von murinen IFN-α auf HBV. mIFN-α inhibierte die HBV-Replikation auf der Ebene der HBV-RNA in vitro und in vivo. Verschiedene mIFN-α-Subtypen zeigten unterschiedliche antivirale Effizienz. Eine weitere Analyse der Protein Aminosäuresequenz offenbarte mehrere potenziell wichtige Reste in der IFN-α-rezeptorbindenden Region. Der zweite Teil charakterisiert den IFN-α-Signalweg in verschiedenen humanen Hepatozyten. Unterschiedliche HBV-replizierende Hepatoma-Zelllinien, wurden verwendet um die Wirkung von IFN-α gegen HBV zu untersuchen und sie mit primären humanen Hepatozyten zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigten, dass IFN-α nur in HBV-infizierten HepaRG-Zellen antivirale Aktivität hervorruft, nicht jedoch in HBV-replizierenden Huh-7- oder HepG2-Zellen. Eine detaillierte Analyse des IFN-α-Signalweges deckte auf, dass in Huh-7- und HepG2-Zellen IFN-α-induzierte Gene kaum zu finden sinf, während HepaRG-Zellen eine ähnliche Induktion von IFN-stimulierten Genen aufzeigen wie PHH. Obwohl die Menge an IFN-α/β-Rezeptor und phosphorylierten STAT (pSTAT) Proteinen in allen getesteten Zelllinien vergleichbar war, war die nukleäre Translokation von p-STATs in HepaRG-Zellen weitaus effizienter. Daher sind HepaRG-Zellen sowie PHH die geeignetsten Modelle für Untersuchungen von IFN-α und HBV und wurden für die weiteren Experimente verwendet. Der dritte Teil der Arbeit beschreibt einen neuen antiviralen Mechanismus von IFN-α, welcher die Bindung des HBV an seine Wirtszelle betrifft. Bei der Kultur von differenzierten HepaRG-Zellen limitierten Zellkulturüberstand von IFN-α-behandelten Zellen die HBV-Infektion. Die Bindung der IFN-α-induzierten Produkte an eine Heparin-Säule implizierte, dass die Faktoren mit HBV um die Bindung an Heparansulfat als unspezifischen Bindefaktor konkurrieren. Massenspektrometrische Analysen detektierte den Komplementfaktor H und Fibronektin 1 als mögliche Inhibitoren der viralen Bindung.Der vierte Teil der Arbeit konzentriert sich auf den Mechanismus der nichtzytopathischen Viruseliminierung durch IFN-α. IFN-α reduzierte signifikant HBV cccDNA, die HBV Transkriptions-Matrize, in HBV-infizierten PHH und HepaRG-Zellen. Eine spezifische 3D-PCR deutete auf Veränderungen in der Sequenz der HBV cccDNA hin. Die Sequenz-Analyse zeigte C-zu-U-Deaminierung der HBV cccDNA nach Behandlung mit IFN-α auf. Zeit- und dosisabhängige Induktion der Expression der APOBEC3 -Cytidindeaminasen A3A und A3G wurde nachgewiesen. Blockierung des JAK-STAT-Signalweges bzw. die Expression des HIV-vif belegte, dass die IFN-α-induzierte Deaminierung der cccDNA durch A3 zur Degradierung der cccDNA führte. Die Analyse der subzellulären Lokalisation und Überexpressionsexperimente zeigten A3A als aktiven Effektor. Die Behandlung mit einer Kombination aus DNA-Reparaturenzymen führte zur Korrektur aller Mutationen in der cccDNA und eine Behandlung mit AP-Endonuklease zur Reduktion der cccDNA, wodurch die Beteiligung des Basenexzisionsweges evident wurde. Eine Deaminierung der genomischen Wirts-DNA unter IFN-α-Behandlung fanden wir nicht, was darauf hindeutete, dass A3A spezifisch zur viralen DNA transportiert wird. Da A3A in der konfokalen Mikroskopie mit dem HBV-Coreprotein kolokalisierte und eine Interaktion durch Co-Immunopräzipitation bestätigt wurde, schlagen wir als Erklärung vor, dass A3A das HBV core benutzt um Zugang zur cccDNA zu erlangen. Zusammen genommen führt die vorliegende Arbeit zu einem besseren Verständnis der antiviralen Funktion von IFN-α und eröffnet neue Optionen für die Entwicklung innovativer und sicherer Behandlungen, die es erlauben HBV zu eliminieren und –hoffentlich – die chronische Hepatitis B zu heilen.
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Publikationstyp Sonstiges: Hochschulschrift
Typ der Hochschulschrift Dissertationsschrift
Quellenangaben Band: , Heft: , Seiten: 151 S. Artikelnummer: , Supplement: ,
Verlag Universitätsbibliothek der TU München
Hochschule Technische Universität
Hochschulort München
Fakultät Fakultät für Medizin